你知道WB實(shí)驗(yàn)操作步驟有哪幾步嗎？

蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)：又稱為免疫印跡，根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合，半定量檢測(cè)樣品中的某種蛋白的方法。基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析條帶的位置和條帶深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況。那么你知道WB實(shí)驗(yàn)操作步驟有哪幾步嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、樣本制備蛋白提取

1.前期準(zhǔn)備：首先要了解你所研究蛋白的內(nèi)源表達(dá)水平，常用的數(shù)據(jù)庫(kù)如Uniport、Atlas、BioGPS，或查閱相關(guān)文獻(xiàn)。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，選擇內(nèi)參蛋白。

2.蛋白提取：是Western Blotting 的第一步，要求選擇樣本新鮮，降低背景，避免反復(fù)凍融，選擇合適的裂解液裂解樣本，選擇合適的蛋白酶或磷酸酶抑制劑，防止蛋白的降解和磷酸化信號(hào)的丟失。

二、蛋白濃度測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的方法包括Lowry法、Bradford法、BCA法，常用的是BCA法，基本原理是在堿性條件下，蛋白將Cu+ +還原為Cu+，Cu+ 與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。

之后加入Loading buffer，含有變性劑，使蛋白質(zhì)變性，釋放二硫鍵，最后煮沸變性保存樣品于-20℃或-80℃。

三、上樣和電泳

1. 制備凝膠：根據(jù)蛋白分子量的大小，選擇合適濃度的分離膠，配膠的APS需要在4℃的冰箱中保存。配膠的試劑中，APS與TEMED是促凝劑，所以在加促凝劑之前，需先把其他組分混勻。

2.上樣：蛋白Marker孔加入5-10μL，多選擇生物素化蛋白Marker，其余蛋白總上樣量20-50μg，組織樣本稍多些上樣，盡量保持每個(gè)泳道的上樣量一致，空泳道用Loading buffer補(bǔ)齊。

3. 電泳：接上電源后，先用80V恒壓電泳濃縮至溴酚藍(lán)指示劑到濃縮膠與分離膠交界處，成線狀，改為恒壓100v--120v直至溴酚藍(lán)電泳到凝膠底部，此過(guò)程約用時(shí)1.5h。

四、轉(zhuǎn)膜

1.膜的選擇：廣泛使用的是NC膜和PVDF膜

2.轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜的方法包括濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)、干轉(zhuǎn)，濕轉(zhuǎn)是轉(zhuǎn)膜最完quan且應(yīng)用zui廣泛的方法，但是所需時(shí)間較長(zhǎng)。

五、封閉和抗體孵育

1.封閉：目的是為了減少膜對(duì)一二抗的非特異吸附，降低背景。將NC膜從濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)中取出，并用TBST潤(rùn)洗2次，每次5 min，然后進(jìn)行封閉。

化學(xué)發(fā)光法：用含5% 脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡NC膜，室溫?fù)u床封閉1-2h；

熒光法：含5% 脫脂奶粉的TBS，脫脂奶粉需選擇實(shí)驗(yàn)室級(jí)別的。

最后再用TBST潤(rùn)洗封閉后的NC膜3次，每次5 min。

2.抗體孵育：一抗能識(shí)別膜上不同種屬的蛋白，買經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的，二抗上帶有發(fā)光底物，只能識(shí)別一抗。

六、顯色曝光

常用的是化學(xué)發(fā)光，抗體上偶聯(lián)的HRP催化ECL發(fā)光底物顯色，取出洗滌的膜后，用濾紙吸干水分，放置于成像儀上，均勻滴加ECL工作液，排出氣泡，開(kāi)始曝光。

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