流式細胞儀的常見問題有哪些？

流式細胞儀(flow cytometry，FCM)作為一種強大的單細胞分析工具，可以對于處在快速直線流動狀態中的細胞或生物顆粒同時進行多參數、快速定量分析和分選的高新技術。那么流式細胞儀的常見問題有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、抗體孵育時間過長會影響檢測結果嗎？

通常情況下，標記細胞表面抗原的熒光抗體需要在室溫孵育20-30分鐘。

對于一些狀態較脆弱的細胞（例如從組織中分離、培養的免疫細胞），切勿過長時間孵育，同時建議使用染色緩沖液（Staining Buffer），其中主要成分為PBS，疊氮鈉和胎牛血清，胎牛血清可以減少抗體的非特異性結合，疊氮鈉可以維持細胞表面抗原的穩定性。

對于胞內或者核內標記抗體，可以在固定、破膜后適當延長孵育時間，或者破核膜同時孵育核內抗體。

二、樣本不能及時上機檢測，血樣和組織樣本的保存方法？

通常情況下建議樣本處理至表面抗體孵育結束，再用1%多聚甲醛重懸固定4℃保存至下一步，或者4%多聚甲醛固定10分鐘后洗去，用StainingBuffer重懸，4℃保存至下一步，48小時內上機檢測。如不具備前處理條件，外周血可以使用流式專用保存管存放，組織樣本剪成小塊后用保存液存放，建議不錯過3天進行前處理和上機檢測。

三、流式細胞儀測細胞周期，各個周期峰分不開，只有一個寬峰是為什么？

①如果是持續出現這種情況，說明儀器的PI檢測通道CV值過高，管路需要深度清潔或者更換。

②前處理過程中出現的問題，如：乙醇固定條件（濃度、時間）的改變造成通透不wan全、RNA沒有處理wan全、通道CV較差同時受到異倍體干擾等。

③如果個別組出現此情況，可能是受到實驗處理條件的影響，如：轉染的熒光干擾、集中在周期區間的抑制、對細胞影響過大等。

四、鈣離子（Ca2+）流式檢測如何設置對照？

Ca2+檢測通常使用Fluo-3、Fluo-4等熒光探針，這類探針通常會在活細胞內與鈣離子結合發出熒光，進行相關成像或流式檢測。因此鈣離子檢測會有靜態檢測和動態檢測兩種方法。

靜態檢測主要用于檢測相對胞內濃度變化，需要設置空白對照、陰性對照、陽性對照，以相對的方式檢測熒光值。

動態檢測主要用于檢測鈣動員的情況，監測加入刺激劑后的Ca2+變化情況。通常用于檢測一些免疫細胞，也可以用于分析不同淋巴細胞亞群的變化情況。

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