細(xì)胞周期檢測的實(shí)驗(yàn)原理和方法

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從上一次分裂完成開始，到下一次分裂完成時(shí)為止，包括兩個(gè)階段：分裂間期和分裂期。細(xì)胞周期檢測的是單個(gè)細(xì)胞的增殖速度，通過縮時(shí)攝影來測定。

一、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞在不同的時(shí)期，細(xì)胞所含的DNA量不同。正常細(xì)胞的二倍體含量通常為2N，則在G/G1期，細(xì)胞的DNA量為2N，而G2M期細(xì)胞DNA含量為4N。S期DNA量為2N-4N。碘化丙錠(PI)可以與細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA結(jié)合，通過RNA酶將RNA消化后，檢測到與DNA結(jié)合的P熒光強(qiáng)度可以直接反映細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。因此，采用流式細(xì)胞術(shù)PI染色法檢測細(xì)胞內(nèi)DNA含量時(shí)，可將細(xì)胞周期分為G/G1期、S期和G2/M期，并通過特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的百分比。

二、實(shí)驗(yàn)方法

測定細(xì)胞周期的方法常見的有同位素標(biāo)記法、流式細(xì)胞儀法、基于細(xì)胞成像的熒光檢測法等。

1.同位素標(biāo)記法

標(biāo)記有絲分裂百分率法 (PLM) 是一種常用的測定細(xì)胞周期時(shí)間的方法。其原理是對測定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時(shí)取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過統(tǒng)計(jì)標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來測定細(xì)胞周期。

檢測原理：

① 待測細(xì)胞經(jīng) 3H- 胸腺嘧啶核苷標(biāo)記后，所有 S 期細(xì)胞均被標(biāo)記。

② S 期細(xì)胞經(jīng) G2 期才進(jìn)入 M 期，所以一段時(shí)間內(nèi) PLM = 0。

③ 開始出現(xiàn)標(biāo)記 M 期細(xì)胞時(shí)，表示處于 S 期最后階段的細(xì)胞，已渡過 G2 期，所以從 PLM = 0 到出現(xiàn) PLM 的時(shí)間間隔為 G2期的持續(xù)時(shí)間。

④ S 期細(xì)胞逐漸進(jìn)入 M 期，PLM 上升，到達(dá)到最高點(diǎn)的時(shí)候說明來自處于 S 最后階段的細(xì)胞，已完成 M，進(jìn)入 G1 期。所以從開始出現(xiàn) M 到 PLM 達(dá)到最高點(diǎn) (≈ 100%) 的時(shí)間間隔就是 M 期的持續(xù)時(shí)間。

⑤ 當(dāng) PLM 開始下降時(shí)，表明處于 S 期最初階段的細(xì)胞也已進(jìn)入 M 期，所以出現(xiàn) LM 到 PLM 又開始下降的一段時(shí)間等于 S 期的持續(xù)時(shí)間。

2.流式細(xì)胞儀 PI 染色法

細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個(gè)階段。間期又分為三期：即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 與 DNA 合成后期 ( G2 期 )。某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后暫時(shí)離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，執(zhí)行一定生物學(xué)功能 ( G0 期 )。

檢測原理：

由于細(xì)胞周期各時(shí)相的 DNA 含量不同，通常正常細(xì)胞的 G1 / G0 期具有二倍體細(xì)胞的 DNA 含量 ( 2N )，而 G2 / M 期具有四倍體細(xì)胞的 DNA 含量 (4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與 DNA 結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi) DNA含量。因此，通過流式細(xì)胞儀 PI 染色法對細(xì)胞內(nèi) DNA 含量進(jìn)行檢測時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為 G1 / G0 期，S 期和 G2 / M期，獲得的流式直方圖對應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的細(xì)胞百分率。

3.基于成像的熒光檢測法

FUCCI (fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator) 小球能鑒別細(xì)胞處在細(xì)胞周期的哪一時(shí)期，因此可以用來研究癌癥細(xì)胞周期的進(jìn)程。FUCCI 技術(shù)建立在鑒定過表達(dá)的兩種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白 geminin 和 Cdt1 水平上，其中 geminin 融合的是綠色熒光基團(tuán) AmCyan，而 Cdt1 融合的是紅色熒光基團(tuán) mCherry。Cdt1 和 geminin 的水平隨著細(xì)胞周期的變化而不斷波動(dòng)：Cdt1 蛋白水平在 G1 階段達(dá)到峰值，而 geminin 蛋白水平在 S，G2 和 M 期不斷升高。這一結(jié)果體現(xiàn)為表達(dá) FUCCI 細(xì)胞核在G1 期為紅色而在 S，G2 和 M 期則呈現(xiàn)綠色。

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