小鼠腦組織解離試劑盒使用方法

百奧益康小鼠腦組織解離試劑盒（貨號(hào)：BA3305）適用于小鼠腦組織的細(xì)胞懸液的分離制備，本產(chǎn)品利用酶溫和、快速有效地破壞細(xì)胞外基質(zhì)，釋放細(xì)胞，從而生成單細(xì)胞懸浮液。制備的單細(xì)胞懸液可用于單細(xì)胞測(cè)序、細(xì)胞培養(yǎng)或其他細(xì)胞相關(guān)檢測(cè)。百奧益康小鼠腦組織解離試劑盒（貨號(hào)：BA3305）怎么使用呢？讓我們一起來(lái)看看小鼠腦組織解離試劑盒的使用方法吧！

一、材料準(zhǔn)備

1. 儀器：水浴鍋（定期手動(dòng)搖晃混勻）或雜交爐（轉(zhuǎn)速 20 ~ 30 轉(zhuǎn)/分鐘）、水平離心機(jī)。

2. 試劑：PBS、FBS、RPMI 1640 培養(yǎng)基。

3. 耗材：低吸附槍頭、離心管、20 μm 和 70 μm 的細(xì)胞篩。

二、操作步驟

準(zhǔn)備工作：水浴鍋或雜交爐設(shè)置到 37℃、配制含 5% FBS 的 PBS。 切取新鮮組織約 200 mg（黃豆粒小），如圖 1。

圖1 新鮮組織樣圖

1. 取一個(gè)5 mL 離心管，加入2160 μL Buffer A，放入用PBS 清洗干凈的組織樣本，并剪碎。

2. 添加800 μL 的 Enzyme B 和10 μL 的Enzyme C，顛倒混勻。

3. 放在37℃水浴鍋或雜交爐中20 ~ 30 min。消化過(guò)程中，使用水浴鍋每隔3 ~ 5 min 手動(dòng)搖晃混勻。使用雜交爐轉(zhuǎn)速20 ~ 30 轉(zhuǎn)/分鐘左右。

4. 每隔3 ~ 5 min 質(zhì)檢一次細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞總量及活性等確定消化停止時(shí)間。

5. 消化完成后，用70 μm 細(xì)胞篩進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液于新的15 mL 離心管中。

6. 加3 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基或 5% FBS 的PBS 于消化的離心管中，上下顛倒涮洗管壁，涮洗液同樣經(jīng)過(guò)同一個(gè)70 μm 細(xì)胞篩進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液于第5 步的15 mL 離心管中。

7. 將收集液于4℃，300 ×g 離心5 min，棄上清。

8. 用5 mL 含5% FBS 的PBS 重懸沉淀，吹打混勻。

9. 放入水平離心機(jī)，4℃，300 ×g 離心5 min，棄上清。

10. 用含5% FBS 的PBS 重懸沉淀至2 mL。

11. 加入1 mL DRS（細(xì)胞碎片去除緩沖液），用5 mL 移液器緩慢吹打混勻10 次。不要渦旋振蕩。

12.沿管壁緩慢加入3 mL PBS，輕輕覆蓋在最上層，千萬(wàn)不要混勻，如圖2。

        圖2                                                                 圖3

13. 務(wù)必使用水平離心機(jī)，并設(shè)置為居中的加速度和減速度，4°C，3000 ×g，離心20 min。

14. 離心后，緩慢取出離心管。溶液分成3 層。緩慢吸出全部上清液（優(yōu)先吸出碎片層），保留細(xì)胞沉淀（上清盡量wan-quan去除干凈），如圖3 和圖4。

注：離心管要輕拿輕放，確保分層明顯，不同層的溶液間不互相混合。

圖 4 小鼠腦細(xì)胞碎片去除示意圖

15. 向沉淀中加入適當(dāng)體積的含5% FBS 的PBS，加入三倍體積的紅細(xì)胞裂解液（BA3311），冰上裂紅5 min。具體可以參考BA3311 紅細(xì)胞裂解液說(shuō)明書(shū)。

16. 加入等體積的PBS 混勻，終止裂紅，4°C，450 ×g，離心5 min，棄上清。

17. 用10 mL 含5% FBS 的PBS 重懸沉淀，吹打混勻，4℃，300 ×g 離心5 min，棄上清。

18. 用50 µL ~ 2 mL 含5% FBS 的PBS 重懸沉淀，根據(jù)所需的細(xì)胞濃度調(diào)整重懸液的體積。

19. 若有明顯細(xì)胞結(jié)團(tuán)，則使用20 μm 細(xì)胞篩進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液于新的離心管中。若無(wú)明顯細(xì)胞結(jié)團(tuán)，則可跳過(guò)此步驟。

20. 用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行質(zhì)控并記錄。質(zhì)控結(jié)束后請(qǐng)立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

在使用的過(guò)程中，請(qǐng)按照百奧益康小鼠腦組織解離試劑盒（貨號(hào)：BA3305）的使用方法來(lái)進(jìn)行使用，若有任何問(wèn)題，請(qǐng)聯(lián)系百奧益康試劑盒代理——北京百奧創(chuàng)新科技有限公司！