siRNA轉(zhuǎn)染標(biāo)準(zhǔn)操作流程

以下是經(jīng)過優(yōu)化的 siRNA轉(zhuǎn)染標(biāo)準(zhǔn)操作流程，整合了關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化與避坑指南，適用于絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞系（貼壁/懸浮），分為 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、操作步驟、質(zhì)控要點(diǎn)三部分：

一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)關(guān)鍵點(diǎn)（轉(zhuǎn)染前必看）

 Day 0：細(xì)胞鋪板

1. 消化細(xì)胞 → 用wanquan培養(yǎng)基 調(diào)整密度 → 每孔接種 0.5mL（貼壁細(xì)胞數(shù)：5-8×10?；懸浮細(xì)胞數(shù)：2×10?）  

2. 37℃培養(yǎng)箱放置 16-24h（目標(biāo)：轉(zhuǎn)染時匯合度≈40%）  

關(guān)鍵細(xì)節(jié)：  

- siRNA工作液濃度 = 儲存濃度×30（例：20μM儲存液→工作液終濃度≈33nM）  

- 轉(zhuǎn)染試劑用量參考說明書（RNAiMAX通常 試劑:siRNA體積比=1:1）  

 Day 2：換液與檢測  

1. 轉(zhuǎn)染后 6h 更換wanquan培養(yǎng)基（高毒性細(xì)胞如原代神經(jīng)元需4h內(nèi)換液）  

2. 繼續(xù)培養(yǎng) 24-72h（基因沉默峰值時間需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）  

 三、質(zhì)控關(guān)鍵步驟（決定成敗！）

 1. 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證（必做）

- 方案1：轉(zhuǎn)染 FAM標(biāo)記siRNA → 24h后熒光顯微鏡觀察（效率＞80%合格）  

- 方案2：共轉(zhuǎn)染 EGFP質(zhì)粒 → 計(jì)算綠色細(xì)胞占比（成本低但間接）  

 2. 沉默效果檢測

 3. 細(xì)胞毒性評估

- MTT法：轉(zhuǎn)染后24h檢測，存活率應(yīng)＞85%  

- 形態(tài)觀察：懸浮細(xì)胞聚團(tuán)、貼壁細(xì)胞空泡化→提示毒性過強(qiáng)  

 四、高頻問題解決方案

五、特殊細(xì)胞優(yōu)化方案

1. 原代細(xì)胞：  

   - 轉(zhuǎn)染試劑：選 DharmaFECT™ Primary 或 jetPRIME®  

   - 方案：轉(zhuǎn)染前饑餓處理2h（無血清培養(yǎng)基）→ 復(fù)合物孵育時間縮短至5min  

2. 懸浮細(xì)胞：  

   - 試劑：Neofect™ DNA/RNA Transfection Reagent  

   - 步驟：離心收集細(xì)胞 → 重懸于復(fù)合物 → 24孔板每孔接種500μL（密度5×10?/mL）  

3. 難轉(zhuǎn)細(xì)胞（如神經(jīng)元）：  

   - 專用試劑：NeuroFect™（佐劑提高穿透性）  

   - 轉(zhuǎn)染后不換液 → 直接補(bǔ)等體積wanquan培養(yǎng)基  

六、試劑耗材推薦表

> 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)：合格實(shí)驗(yàn)需滿足——轉(zhuǎn)染效率＞80% + 沉默效率＞70% + 細(xì)胞存活＞85%

避雷總結(jié)：  

1. 勿用含抗生素或血清的培養(yǎng)基稀釋復(fù)合物（滅活試劑）  

2. 轉(zhuǎn)染后換液時間寧早勿晚（超8h毒性飆升）  

3. 凍存siRNA避免反復(fù)凍融＞3次（分裝儲存-80℃）  

按照此流程操作，可穩(wěn)定獲得可重復(fù)的基因沉默數(shù)據(jù)！

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